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微生物菌种样品的处理和稀释方法
      
  1.操纵方法:以无菌操纵取检样25g(或25ml),放于225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内预置适当数目的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振要或研磨制成1:10的均匀稀释液。
  固体检样在加进稀释液后,最好置灭菌均质器中以8000~10000r/min的速度处理1min,制成1:10的均匀稀释液。
  用1ml灭菌吸管吸取1:10稀释液1ml,沿管壁渐渐注进含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇试管混合均匀,制成1:100的稀释液。
  另取1ml灭菌吸管,按上项操纵顺序,制10倍递增稀释液,如此每递增稀释一次即换用1支1ml灭菌吸管。
  2.无菌操纵:操纵中必须有“无菌操纵”的概念,所用玻璃器皿必须是完全灭菌的,不得残留有细菌或抑菌物质。所用剪刀、镊子等用具也必须进行消毒处理。样品假如有包装,应用75%乙醇在包装开口处擦拭后取样。
  操纵应当在超净工作台或经过消毒处理的无菌室进行。琼脂平板在工作台暴露15分钟,每个平板不得超过15个菌落。
  3.采样的代表性:如系固体样品,取样时不应集中一点,宜多采几个部位。固体样品必须经过均质或研磨,液体样品须经过振摇,以获得均匀稀释液。
  4.样品稀释误差:为减少样品稀释误差,在连续递次稀释时,每一稀释液应充分振摇,使其均匀,同时每一稀释度应更换一支吸管。
  在进行连续稀释时,应将吸管内液体沿管壁流进,勿使吸管尖端伸进稀释液内,以免吸管外部粘附的检液溶于其内。
  为减少稀释误差,SNbeat365娱乐官网_beat365可靠吗_beat365语言设置采用取10mL稀释液,注进90mL缓冲液中。
  5.稀释液:样品稀释液主要是灭菌生理盐水,有的采用磷酸盐缓冲液(或0.1%蛋白胨水),后者对食品已受损伤的细菌细胞有一定的保护作用。如对含盐量较高的食品(如酱油)进行稀释,可以采用灭菌蒸馏水。
  (二)倾注培养
  1.操纵方法:根据beat365娱乐官网_beat365可靠吗_beat365语言设置要求或对污染情况的估计,选择2~3个适宜稀释度,分别在制10倍递增稀释的同时,以吸取该稀释度的吸管移取1ml稀释液于灭菌平皿中,每个稀释度做两个平皿。
  将凉至46℃营养琼脂培养基注进平皿约15ml,并转动平皿,混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾进加有1ml稀释液(不含样品)的灭菌平皿内作空缺对照。
  待琼脂凝固后,翻转平板,置36±1℃温箱内培养48±2h,取出计算平板内菌落数目,乘以稀释倍数,即得每克(每毫升)样品所含菌落总数。
  2.倾注用培养基应在46℃水浴内保温,温度过高会影响细菌生长,过低琼脂易于凝因而不能与菌液充分混匀。如无水浴,应以皮肤感受较热而不烫为宜。
  倾注培养基的量规定不一,从12~20ml不等,一般以15ml较为适宜,平板过厚可影响观察,太薄又易于干裂。倾注时,培基底部如有沉淀物,应将底部弃往,以免与菌落混淆而影响计数观察。
  3.为使菌落能在平板上均匀分布,检液加进平皿后,应尽快倾注培养基并旋转混匀,可正反两个方向旋转,检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min,以防止细菌有所死亡或繁殖。。
  4.培养温度一般为37℃(水产品的培养温度,由于其生活环境水温较低,故多采用30℃)。培养时间一般为48h,有些方法只要求24h的培养即可计数。培养箱应保持一定的湿度,琼脂平板培养48h后,培养基失重不应超过15%。
  5.为了避免食品中的微小颗粒或培基中的杂质与细菌菌落发生混淆,不易分辨,可同时作一稀释液与琼脂培基混合的平板,不经培养,而于4℃环境中放置,以便计数时作对照观察。
  在某些场合,为了防止食品颗粒与菌落混淆不清,可在营养琼脂中加进氯化三苯四氮唑(TTC),培养后菌落呈红色,易于分别。
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